GEN MÜHƏNDİSLİYİ – hәr hansı istәnilәn orqanizmin genetik informasiyasının istiqamәtli kombinasiyasını hәyata keçirmәyә kömәk edәn biokimya vә molekulyar genetikanın metodlar mәcmusu. G.m. taksonomik cәhәtdәn uzaq orqanizm növlәri arasında genetik informasiya mübadilәsinә mane olan növarası tәbii baryerlәri aradan qaldırır, hәmçinin tәbiәtdә mövcud olmayan gen uyarlığına, qabaqcadan müәyyәn edilmiş xassәlәrә malik hüceyrә vә orqanizmlәr yaratmağa imkan verir. G.m.-nin başlıca tәsir obyekti, molekulu adәtәn 2 zәncirdәn ibarәt olan genetik informasiya daşıyıcısı DNT-dir. Purin vә pirimidin әsaslarının cütlәşmәsinin dәqiq spesifikliyi komplementarlıq xassәsini, yәni 2 zәncirli nukleotidlәrin qarşılıqlı uyğunlaşmasına sәbәb olur. Genlәrin yeni uyğunlaşmalarının yaranması bütün orqanizm növlәrindә DNT molekulu quruluşunun prinsipial oxşarlığı sayәsindә mümkün olmuşdur, genetik kodun faktiki universallığı isә istәnilәn hüceyrәdә yad genlәrin ekspressiyasını (onların funksional fәallığının aşkara çıxması) tәmin edir. Buna, hәmçinin nuklein turşuları kimyası sahәsindә biliklәrin artması, genlәrin tәşkilinin vә fәaliyyәtinin molekulyar xüsusiyyәtlәrinin aşkara çıxarılması (o cümlәdәn onların ekspressiyasının tәnzimlәnmәsi mexanizmlәrinin vә genlәrin tәnzimlәyicisi “yad” elementlәrin tәsirinә tabeolma imkanlarının müәyyәnlәşdirilmәsi), DNT-nin sekvenlәşdirilmәsi üsulunun işlәnib-hazırlanması, DNT-nin istәnilәn fraqmentinin sürәtlә sintez edilmәsi ilә nәticәlәnәn polimeraza zәncir reaksiyasının kәşfi sәbәb oldu. Avtonom replikasiyaya qabil vә bir bakteriya hüceyrәsindәn digәrinә keçә bilәn plazmidlәrin kәşfi vә bәzi genlәrin bakteriofaqlarla daşınması, yәni vektorlar (gen daşıyıcıları molekulları) anlayışının formalaşmasına sәbәb olan transduksiya hadisәsi G.m.-nin yaranması üçün mühüm zәmin oldu.
G.m. metodologiyasının inkişafında nuklein turşularının yenidәn әmәlә gәlmәsindә iştirak edәn fermentlәrin böyük rolu olmuşdur: restriktazalar (DNT molekullarında müәyyәn ciddi ardıcıllıqla yerlәşәn saytları tanıyır vә DNT-nin ikiqat zәncirini restriksiya saytında bir-birindәn ayırır), DNT-liqazalar (DNT-nin ayrı-ayrı fraqmentlәrini kovalent әlaqәlәndirir), әks transkriptaza RNT matrisası üzәrindә DNT-nin, yaxud kDNT-nin komplementar surәtini sintez edir vә s. Süni strukturların yaradılması yalnız bunların sayәsindә texniki cәhәtdәn mümkün olmuşdur. DNT-nin fәrdi fraqmentlәrinin (genlәrin) alınması, DNT plazmidlәrin vә virusların DNT әsasında molekulyar hüceyrәlәrin-rekombinant DNT (rekDNT) yaradılması üçün fermentlәrdәn istifadә edilir. Sonuncular sahibin hüceyrәsinә lazımi geni çatdırmaqla orada onun çoxalmasını (klonlaşmasını) vә genin son mәhsulunun yaranmasını (onun ekspressiyasını) tәmin edir.
DNT-nin rekombinant molekullarının yaradılma prinsiplәri. 1972 ildә P.Berq vә әmәkdaşları tәrәfindәn ilk dәfә rekombinant DNT (bağırsaq çöpü bakteriyalarının, onun ƛ bakteriofaq virusunun meymunun SV 40 virusunun DNT fraqmentlәrinin birlәşdirildiyi hibrid DNT) alındıqdan sonra G.m. termini yayılmağa başladı. 1973 ildә S.Koen әmәkdaşları ilә birlikdә PSC 101 plazmidadan vә onu elә yerindәn qıraraq ikizәncirli DNT molekulunun sonunda qısa, komplementar birzәncirli “quyruq” (adәtәn u–6 nukleotidlәr) әmәlә gәtirәn restriktazadan (EcoRI) istifadә edilir.
rekDNT alınmasının әsas müasir strategiyası bunlardan ibarәtdir: 1) xromosomdan asılı olmayaraq çoxala bilәn plazmidlәrin vә ya virusların DNT-sinә tәdqiqatçı üçün maraqlı tәrkibi olan müәyyәn genlәri, yaxud süni surәtdә alınan nukleotid ardıcıllığı olan başqa orqanizmlәrә mәxsus DNT fraqmentlәri qoşurlar; 2) belәliklә әmәlә gәlәn hibrid molekullarını burada qurulan DNT fraqmentlәri ilә birlikdә replikasiya olunduqları (çoxalır, amplifikasiya olunur) hәssas prokariot vә eukariot hüceyrәlәrә daxil edirlәr; 3) tәrkibindә rekDNT molekullarının lazımi tiplәri olan xüsusi qida mühitindә hüceyrә klonlarını koloniya şәklindә seçir vә onları strukturfunksional cәhәtdәn hәrtәrәfli öyrәnirlәr. rekDNT olan hüceyrәlәrin seçimini asanlaşdırmaq üçün tәrkibindә bir vә daha çox markerlәr olan vektorlardan istifadә edirlәr. Molekulyar klonlaşdırma tәcrübәlәrindә 2 әsas prinsipә riayәt edilir: rekDNT-nin klonlaşdırılma gedәn hüceyrәlәrdәn heç biri birdәn artıq plazmid molekulu, yaxud virus hissәciyi almamalıdır; sonuncular replikasiya qabiliyyәtli olmalıdır.
G.m.-ndә plazmid vә virus DNT-lәrinin geniş spektrındәn vektor molekulları kimi istifadә edilir. Tәrkibindә bir neçә genetik marker olan müxtәlif restriktazaların hәr biri üçün bir tәsir yerinә malik klonlaşdırıcı vektorlar daha populyardır. p BR 322 plazmidi belә tәlәbata әn yaxşı cavab verir; bu plazmid rekDNT ilә işlәyәrkәn tәtbiq edilәn, tәbiәtdә mövcud olan ilk plazmidlәrin kömәyi ilә qurulmuşdur; onun tәrkibindә ampisilinә vә tetrasiklinә, hәmçinin 19 müxtәlif restriktaza üçün tanıma saytına davamlı genlәr vardır. Klonlaşdırıcı vektorların xüsusi halı olan ekspressiya edәn vektorlar amplifikasiya ilә yanaşı resipient hüceyrәlәrdә yad genlәrin düzgün vә effektiv ekspressiyasını tәmin edirlәr. Bәzi hallarda molekulyar vektorlar hüceyrә, yaxud virus genomunda yad DNT-nin inteqrasiyasını tәmin edir.
Bakteriya vә yaxud maya ştammlarının, heyvan vә bitki, hәmçinin onlara klonlaşdırılan genlәrin effektiv ekspressiyasını tәmin edәn transgen heyvan vә bitkilәrdә toxuma hüceyrәlәri xәttinin yaradılması G.m.-nin әn mühüm vәzifәlәrindәn biridir. Genlәr çoxsurәtli vektorlarda klonlaşdırıldıqda, yәni hüceyrәdә mәqsәdli gen çox toplandıqda yüksәk sәviyyәli zülal mәhsulları almaq olur. Əsas odur ki, DNT-nin kodlaşdıran ardıcıllığı hüceyrәnin RNT-polimerazası tәrәfindәn effektiv surәtdә ta- nınan promotorun nәzarәti altında olsun, әmәlә gәlәn mRNT isә nisbәtәn stabil olsun vә effektiv translyasiya edilsin. Bundan başqa, resipiyent hüceyrәlәrdә sintez edilәn yad zülal hüceyrәdaxili proteazalar tәrәfindәn sürәtli deqradasiyaya mәruz qalmamalıdır. Transgen heyvan vә bitkilәrin yaradılması zamanı çox vaxt yeridilәn mәqsәdli genlәrin xüsusi toxuma üçün spesifik ekspressiyası әldә edilir.
Genetik kod universal olduğu üçün genin ekspressivliyi imkanı onun tәrkibindә yalnız sahib hüceyrә tәrәfindәn düzgün tanınan transkripsiya vә translyasiyanın inisiasiya vә terminasiya siqnallarının olması ilә müәyyәn edilir. Belә ki, ali eukariotlardakı genlәrin әksәriyyәti fasilәli (qeyri-müntәzәm) ekzon-intron quruluşa malikdir; belә genlәrin transkripsiyası nәticәsindә matrisa sәlәf RNT-si (pre-mRNT) әmәlә gәlir, bundan da növbәti splaysinq zamanı kodlaşdırılmayan ardıcıllıqlar olan intronlar ayrılır vә yetkin mRNT yaranır. Belә genlәr splaysinq sisteminin olmadığı bakteriya hüceyrәlәrindә ekspessiya edilә bilmir. Bu maniyәni aradan qaldırmaqdan ötrü yetkin mRNT molekulları üzәrindә әks transkriptazanın kömәyi ilә surәt DNT-si sintez olunur ki, ona DNT polimerazanın vasitәsilә ikinci zәncir qurulur. Genlәrin kodlaşdırılmış ardıcıllığına uyğun gәlәn DNT-nin belә fraqmentlәrini (intronlarla artıq ayrılmayan) müvafiq molekul vektoruna düzmәk olur.
Gen mühәndisliyinin әhәmiyyәti. Müxtәlif tipli hüceyrәlәrә yad DNT yeritmәk vә onun funksiyalarının tәdqiqini mümkün etdiyi üçün G.m. molekulyar biologiyanın eksperimental sәrhәdlәrini xeyli genişlәndirdi. Bu, müxtәlif orqanizmlәrdә genetik informasiyanın qurulması vә tәsvir edilmәsinin ümumbioloji qanunauyğunluqlarını aşkara çıxarmağa imkan verdi. Belә yanaşma, bioloji aktiv maddәlәrin, prinsipcә yeni mikrobioloji produsentlәrinin, hәmçinin fәal yad genlәr daşıyan heyvan vә bitkilәrin yaradılması üçün perspektivlәr açdı. Əvvәllәr alınması әlçatmaz olan, insanın, bir çox bioloji aktiv zülalları, o cümlәdәn interferon, interleykin, peptid hormonları, qan faktorları, bakteriyalar, maya göbәlәklәri vә mәmәlilәrin hüceyrәlәrindә çoxlu miqdarda hasil edilmәyә vә tibdә geniş tәtbiq olunmağa başlandı. İki vә daha çox tәbii zülal xassәli ximer peptidlәri kodlaşdıran süni genlәr almaq üçün imkan yarandı. Bütün bunlar biotexnologiyanın inkişafına güclü tәkan verdi.
G.m.-nin başlıca obyektlәri Escherichia coli (bağırsaq çöpü) vә Bacillus subtilis (ot basili), çörәk maya göbәlәklәri Saccharomices cerevisiae, mәmәlilәrin müxtәlif hüceyrә xәtlәridir. Gen mühәndisliyinin tәsir obyektlәrinin spektri daim genişlәnir. Transgen heyvan vә bitkilәrin yaradılması üzrә tәdqiqat istiqamәtlәri intensiv surәtdә inkişaf edir. G.m. metodları ilә müxtәlif infeksion agentlәr әleyhinә vaksinlәrin (bunlardan birincisi insanda hepatit B virusunun sәthi zülalını hasil edәn maya göbәlәklәrinin әsasında yaradılmışdır) әn yeni nәsillәri yaranır. Mәmәlilәrin virusları әsasında klonlaşdırıcı vektorların işlәnib hazırlanmasına, onlardan baytarlığın vә tibbin ehtiyaclarını ödәmәk üçün canlı polivalent vaksinlәr yaradılması vә hәmçinin xәrçәng şişlәrinin vә irsi xәstәliklәrin gen terapiyası üçün molekulyar vektorlar kimi istifadә edilmәsinә böyük diqqәt yetirilir. İnsan vә heyvan orqanizminә müxtәlif yoluxucu agentlәrin (DNT vaksinlәşdirmә) antigenlәrindәn ibarәt mәhsulları onların hüceyrәsinә yönәldәn rekDNT-nin birbaşa yeridilmәsi metodu işlәnib hazırlanmışdır. İnfeksiya törәdicilәrinin immunogen zülallarını hasil edәn pomidor, yerkökü, kartof, qarğıdalı, kahı kimi transgen bitkilәr әsasında yemәli vaksinlәrin yaradılması G.m.-ndә әn yeni istiqamәtdir.
Gen-mühәndislik eksperimentlәrinin keçirilmәsi ilә bağlı ehtiyat tәdbirlәri. rekDNT alınmasının ilk müvәffәqiyyәtli eksperimentlәrindәn sonra, tezliklә P.Berq başda olmaqla bir qrup alim bir sıra gen-mühәndislik tәcrübәlәrinin keçirilmәsinin mәhdudlaşdırılmasını tәklif etdi. Bu ehtiyat tәdbirlәri onunla әlaqәdar idi ki, tәrkibindә yad genetik informasiya daşıyan orqanizmlәrin xassәlәrini qabaqcadan bilmәk çәtindir. Onlar arzuedilmәyәn әlamәtlәrә, ekoloji tarazlığın pozulmasına, insan, heyvan vә bitkilәrdә qeyri-adi xәstәliklәrin yaranmasına vә yayılmasına sәbәb ola bilәr. Bundan başqa, qeyd edilirdi ki, canlı orqanizmlәrin genetik aparatına insanın müdaxilәsi әxlaq qaydalarına ziddir vә arzuedilmәz ictimai vә etik nәticәlәrә gәtirib çıxara bilәr. Bu problemlәr 1975 ildә Asilomarda (ABŞ) keçirilәn Beynәlxalq konfransda müzakirә edilmişdir. Orada müәyyәn qayda vә tövsiyәlәrә riayәt olunmaqla G.m. metodlarından istifadәnin davam etdirilmәsinin vacibliyi qәrarı verildi.
Sonralar bir sıra ölkәlәrdә qoyulan bu qaydalar xeyli yumşaldıldı vә әtraf mühitdә bioloji agentlәrin yayılmasına, tәbii şәraitdә çoxalmayan tәhlükәsiz vektorlardan vә resipiyent hüceyrәlәrdәn istifadә edilmәsi mikrobioloji tәdqiqatlarda olan qaydalar üzrә aparılmağa, bәrabәr oldu.
Çox vaxt G.m. dedikdә, yalnız rekDNT ilә işlәmәk başa düşülür. G.m. sinonimlәri kimi “molekulyar klonlaşdırma”, “DNT klonlaşdırılması”, “genlәrin klonlaşdırılması” terminlәrindәn istifadә edilir. Lakin bütün bu anlayışlar yalnız gen-mühәndislik әmәliyyatının ayrı-ayrı mәzmununu әks etdirir vә ona görә dә “G.m.” termininә ekvivalent deyildir.
